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CRISPR: a galeria de "PROCURADOS" dos microrganismos


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Apesar da popularidade do sistema CRISPR ter atingido seu pico por volta dos anos de 2012/2013, as regiões do DNA (ou ácido desoxirribonucleico, ADN, em português) envolvidas nesse sistema já tinham sido descritas em 1987 e as proteínas envolvidas também já eram velhas conhecidas dos biólogos desde 2002. Vamos começar do básico: o que é esse tal de CRISPR, afinal? E por que ele se tornou uma ferramenta tão importante?


Misteriosas sequências repetidas no ADN


O nome CRISPR foi cunhado por um grupo de pesquisas holandês e é uma abreviação para Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats ou, em português, conjunto de curtas repetições palindrômicas regularmente espaçadas. É muita palavra em um nome só, eu sei, mas vem comigo, vamos entender essa parada.


Em 1987, um cientista japonês chamado Yoshizumi Ishino e seus colegas da Universidade de Osaka, no Japão, estavam pesquisando um gene da bactéria Escherichia coli chamado iap e, para melhor entendê-lo, sequenciaram não só o gene mas também as regiões de ADN ao seu redor. Curiosamente, perto do gene iap os cientistas observaram cinco segmentos idênticos de ADN, sequências repetidas de bases de ADN.



Você se lembra?

As unidades do ADN são as bases nitrogenadas. Existem quatro tipos básicos de bases nitrogenadas, representadas pelas letras A (adenosina), T (timina), C (citosina) e G (guanina). Quando falamos em sequência de bases de ADN, estamos falando da sequência dessas letrinhas: ATCGAT....Esses blocos construtores do ADN também podem ser chamados de nucleotídeos.


Essas sequências repetidas de ADN eram formadas por 29 bases nitrogenadas e cada bloco das mesmas 29 bases se repetia cinco vezes no ADN da E. coli investigada. Essas sequências repetidas estavam separadas umas das outras por blocos de 32 nucleotídeos cada. Esses 32 nucleotídeos, chamados de sequências espaçadoras, eram diferentes dos blocos de 29 bases; essas sequências diferiam entre si quanto à suas bases nitrogenadas. Intrigados, os cientistas não conseguiram explicar a função desse achado na época. Nos anos 90, quando os métodos de sequenciamento de ADN se tornaram mais avançados, essas repetições intercaladas por espaçadores no ADN (ainda que contivessem tamanhos e configurações diferentes de organismo para organismo) foram descritas para uma variedade enorme de bactérias e arqueas. A comunidade científica começou a suspeitar de que o CRISPR deveria cumprir alguma função importante nessas células procarióticas.


Exemplo de configuração geral do CRISPR na molécula de ADN.

O mesmo grupo holandês que cunhou o nome CRISPR percebeu que, nas sequências de ADN próximas aos blocos repetidos e às sequências espaçadoras, existiam sempre os mesmos tipos de gene: genes que codificam para proteínas capazes de cortar o ADN! Os cientistas chamaram a esses genes de Cas, referente a Crispr-ASsociated genes (ou genes associados ao CRISPR). No entanto, ninguém foi capaz de explicar se existia algum motivo por trás da proximidade, no ADN, entre os genes Cas e o CRISPR.


A chave do enigma: espaçadores com ADN "alien"


Em 2005, três times de pesquisa diferentes perceberam o mesmo fato inusitado sobre as sequências espaçadoras do CRISPR: elas se pareciam muito com sequências do ADN de alguns vírus! Seriam as sequências espaçadoras, na verdade, ADNs "aliens"? ADNs estrangeiros inseridos no meio do ADN bacteriano? A fascinante novidade sobre a similaridade entre os espaçadores do CRISPR e o ADN viral chegou aos ouvidos do biólogo evolucionista do National Center for Biotechnology Information, Dr. Eugene Koonin.



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"E se..." raciocinou o Dr. Koonin "...e se o CRISPR for um modo de defesa das bactérias contra os vírus?"





Até mesmo as bactérias estão suscetíveis à ataques por vírus. O Dr. Koonin já conhecia alguns dos sistemas de defesa das bactérias e pensou que o CRISPR, juntamente com as proteínas Cas, poderiam compor mais um desses sistemas. O biólogo evolucionista então propôs que as bactérias usassem as proteínas Cas (capazes de cortar ADN) para cortar pedaços do ADN dos vírus invasores e inserir esses pedaços de ADN no meio do seu próprio ADN (o material genético viral seria de alguma forma inserido entre os blocos de bases repetidas do CRISPR). Dessa forma, da próxima vez que aquele vírus específico - que teve um pedaço do seu ADN inserido entre os blocos repetidos do CRISPR - invadisse aquela célula, a bactéria poderia usar o pedaço de ADN viral inserido no CRISPR como uma espécie de "cola" para reconhecer o vírus invasor e iniciar os procedimentos para eliminá-lo. Dessa forma, a coleção de espaçadores presentes no CRISPR das bactérias serviria como uma espécie de galeria molecular de "procurados" que, assim como no antigo velho oeste, conteria os perfis de indivíduos considerados ameaças.


Muito prazer, sistema CRISPR-Cas


O time de pesquisadores sob a tutela da cientista Jennifer Doudna, professora da Universidade da Califórnia em Berkeley, foi um dos primeiros grupos a desvendar que o CRISPR e as proteínas Cas trabalham juntos para imunizar as bactérias contra vírus invasores. Os diversos tipos de proteínas Cas são os responsáveis por executar as três fases da imunidade via sistema CRISPR-Cas: (1) adaptação, (2) expressão e (3) interferência.


(1) ADAPTAÇÃO

Durante essa fase, dois tipos de proteína Cas - Cas1 e Cas2 - detectam moléculas de ADN estrangeiro que tenham adentrado a célula bacteriana. Uma vez que o ADN viral foi detectado, Cas1 e Cas2 cortam um pedaço específico desse ADN, processam esse fragmento, e o inserem como espaçador na matriz do CRISPR.

Cas1 e Cas2 normalmente "escolhem" sempre a mesma ponta da sequência do CRIPSR no ADN bacteriano para adicionar novos espaçadores, fazendo com que a galeria do CRISPR também seja um registro cronológico das infecções pelas quais a bactéria já passou.


(2) EXPRESSÃO

Partes integrais do ADN bacteriano, os espaçadores acabam sendo transcritos, como qualquer outro gene do ADN, para se tornarem moléculas de ácido ribonucleico, ou ARN.


Você se lembra?

Os nucleotídeos do ADN são o código genético, ou a receita, que contém a informação para fazer as proteínas que compõe as células dos seres vivos. Para que as proteínas aconteçam, é necessário que a informação contida no ADN (a sequência de bases nitrogenadas) seja usada de molde para a confecção de uma molécula de ARN num processo que chamamos de transcrição. O ARN formado do ADN é complementar a este, embora suas unidades tenham fórmulas químicas diferentes. Posteriormente, a molécula de ARN será "lida", ou - mais cientificamente falando - traduzida pelo ARN ribossômico para dar origem à uma proteína. Quando um gene no ADN é transcrito em uma molécula de ARN e traduzido em uma proteína, nós dizemos que este gene está sendo expresso.


Os ARNs obtidos dos espaçadores não passam pelo processo da tradução para virar proteínas. Ao invés disso, eles são processados e a molécula de ARN resultante desse processamento forma um complexo com tipos específicos de proteína, como a Cas9.



(3) INTERFERÊNCIA

O complexo formado entre o ARN do espaçador e a Cas9 é uma verdadeira arma de alta precisão. Nesse complexo, a molécula de ARN funciona como uma espécie de guia para a proteína Cas9. O complexo ARN guia-Cas9 ronda a célula e, se encontrar um fragmento de ADN que contenha um código complementar ao do ARN guia, o ARN guia vai se associar quimicamente ao ADN encontrado e a proteína Cas9 vai, então, clivar esse ADN, interferindo no ciclo viral e impedindo o vírus de se multiplicar e destruir a célula bacteriana.


Os sistemas CRISPR-Cas encontrados na natureza possuem arquiteturas únicas e já foram descritas duas classes diferentes desse sistema, cada uma contendo diferentes subtipos aonde diferentes proteínas são empregadas. Dentro de uma mesma espécie, o sistema CRISPR-Cas já vai variar bastante de um indivíduo para o outro porque micróbios diferentes encontram com vírus diferentes ao longo dos seus ciclos de vida. Embora a academia tenha avançado bastante para entender melhor o sistema CRISPR-Cas, ainda há muito para ser investigado sobre os diferentes componentes que fazem parte dele e sobre possíveis funções desse sistema que vão além de imunizar a célula.


Bactérias e arqueas: não tão primitivas afinal


Um ponto interessante é que, antes da descoberta do sistema CRISPR-Cas, acreditava-se que as bactérias possuíam apenas estratégias mais simples para combater os vírus. As enzimas de restrição, por exemplo, são proteínas que clivam qualquer molécula de ADN percebida como "não bacteriana". Essas estratégias mais simples destroem os invasores focando em características gerais dos mesmos; os cientistas se referem a esse tipo de defesa como imunidade inata. Nós também possuímos imunidade inata, como os fagócitos, que detectam e matam células não nativas do corpo humano.


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Além da imunidade inata, também possuímos um tipo de imunidade mais especializada, que se adapta para reconhecer e destruir invasores novos: a imunidade adquirida. Quando contraímos sarampo, por exemplo, nossa imunidade adquirida leva apenas alguns dias para detectar o vírus, fabricar células brancas "sob medida" e eliminar a doença. Passamos a vida inteira sem pegar sarampo novamente graças à memória imunológica presente nessas células brancas. Da mesma forma, o sistema CRISPR-Cas se adapta para reconhecer invasores novos e cria uma memória imunológica e molecular para garantir à célula proteção permanente contra invasores específicos. A imunidade adquirida das bactérias e arqueas dura até mais tempo do que a nossa porque, como as sequências espaçadoras estão inseridas no ADN, elas passam de geração para geração. As nossas células brancas morrem conosco e nossa(o)s filha(o)s precisam desenvolver do zero as próprias células de defesa.



E eu com isso?


Não demorou muito para que alguns cientistas enxergassem no CRISPR-Cas a oportunidade para desenvolver uma ferramenta capaz de editar o ADN. Se o ARN que se associa à proteína Cas9 for manipulado para conter uma sequência específica, o complexo ARN-Cas9 será guiado pelo ARN manipulado para fazer um corte preciso no loco do ADN escolhido pela/o pesquisadora/or. Dessa forma, juntamente com outras estratégias já disponíveis, o sistema CRISPR-Cas pode contribuir para que genomas sejam editados com maior precisão. Esse sistema é tão revolucionário porque, comparado com outros métodos de engenharia genética que já tínhamos disponíveis, ele é muito mais barato (pode ser obtido de qualquer célula de E. coli, por exemplo) e rápido.


Mais especificamente, o CRISPR-Cas9 já foi empregado em diversas aplicações: atacar o ADN de bactérias resistentes à antibióticos, consertar mutações genéticas nocivas em células humanas, e tratamento de infecções virais como HIV e hepatite B. Ainda tem muito chão para explorarmos todas as possibilidades oferecidas por esse sistema fascinante!







Pensa aqui comigo, rapidinho






A ciência é muito mais algo construído gradativamente pelo trabalho de várias pessoas do que aquela imagem de um cientista só sacando tudo e falando sozinho "Eureka!". É só ver a história da descoberta do CRISPR: o acúmulo do conhecimento originário da contribuição de vários cientistas ao longo de anos foi o que permitiu compreendermos o que é o CRISPR hoje.


Quando fazemos ciência, criar hipóteses que podem parecer loucas é essencial. Ainda bem que o Dr. Koonin teve coragem de falar em voz alta para alguém que achava que as bactérias estavam colocando ADN viral no meio do seu próprio ADN.


Às vezes achamos que seres vivos mais simples, como as bactérias, são "menos evoluídos". Esse conceito está errado. Se tanto nós, humanos, quanto as bactérias ainda não fomos extintos, é porque ambas as nossas estratégias de sobrevivência estão dando certo até agora. Olha só para a elegância e complexidade do sistema CRISPR-Cas...Esses micróbios até conseguem garantir para sua prole o seu próprio sistema de defesa adquirido, enquanto nós...


Quem se lembra da teoria evolutiva de Lamarck? O naturalista nascido no século XVIII que falava que as experiências do indivíduo alteram sua genética? Por exemplo, ele argumentou que uma girafa conseguiria fazer seu pescoço ficar mais longo durante sua vida ao se esforçar para conseguir comer de galhos mais altos e que essa mesma girafa conseguiria passar essa característica adquirida para sua prole. Por muito tempo essa ideia foi refutada pela genética moderna.....mas, se olharmos para como o sistema CRISPR-Cas funciona, de repente Lamarck não estava "viajando" tanto assim...



Referências


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